时空组学研究进展（四）｜单细胞全基因组测序

期刊：Science China-Life Sciences

影响因(yīn)子：8.0

生命科学研究的(de)显微镜化证明，基(jī)於(yú)細(xì)胞群的(de)方法(fǎ)可能不(bù)适用於(yú)某些领域的(de)研究，如腫(zhǒng)瘤的(de)异质性(xìng)和(hé)早期胚胎發(fā)展作为回应，2009年單(dān)細(xì)胞转录組(zǔ)測(cè)序(xù)技(jì)术的(de)引(yǐn)入标志着一项重大(dà)进步（Tang，2009）。在(zài)此基(jī)础上，Navin等人（2011）於(yú)2011年将全基(jī)因(yīn)組(zǔ)扩增（WGA）与高通(tōng)量測(cè)序(xù)相结合，引(yǐn)入了(le)單(dān)細(xì)胞全基(jī)因(yīn)組(zǔ)測(cè)序(xù)技(jì)术（scWGS）。這(zhè)种創(chuàng)新的(de)方法(fǎ)解决了(le)获取組(zǔ)织样本(běn)中不(bù)同細(xì)胞之间异质性(xìng)信息的(de)挑战，当传统測(cè)序(xù)由於(yú)样本(běn)量小而不(bù)切实际时，可以研究單(dān)个細(xì)胞。通(tōng)过在(zài)單(dān)細(xì)胞水平上的(de)DNA測(cè)序(xù)，scWGS为研究單(dān)个細(xì)胞的(de)行为和(hé)机制(zhì)提供了(le)一个新的(de)维度。scWGS的(de)应用已经扩展到各个研究领域，包括(kuò)神经科学、种系进化、器官發(fā)生、腫(zhǒng)瘤学、临牀(chuáng)诊断、免疫学、微生物学、胚胎發(fā)育和(hé)産(chǎn)前遗传学诊断。认识到其潜力，scWGS被《自然方法(fǎ)》杂志强调为2013年最受期待的(de)技(jì)术之一。

scWGS的(de)發(fā)展确实为研究人员在(zài)單(dān)細(xì)胞水平上探索細(xì)胞间异质性(xìng)，探索單(dān)核苷酸變(biàn)异、短插入或缺失、拷贝數(shù)變(biàn)异等各个方麪(miàn)开辟了(le)途径。该技(jì)术已被证明对研究具有生物学或临牀(chuáng)意义的(de)罕见細(xì)胞的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)特别有价值，包括(kuò)循环腫(zhǒng)瘤細(xì)胞和(hé)用於(yú)第三代躰(tǐ)外受精植入前遗传学诊断/筛选的(de)細(xì)胞。scWGS过程通(tōng)常包括(kuò)三个主要步骤：單(dān)細(xì)胞分(fēn)离、單(dān)細(xì)胞全基(jī)因(yīn)組(zǔ)扩增（scWGA）和(hé)扩增産(chǎn)物的(de)測(cè)序(xù)和(hé)分(fēn)析。這(zhè)一过程中的(de)关键挑战是(shì)有效地扩增單(dān)个細(xì)胞的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)，获得足够的(de)材料用於(yú)下游分(fēn)析，同时最大(dà)限(xiàn)度地减少扩增偏倚、基(jī)因(yīn)組(zǔ)丢失、突變(biàn)和(hé)嵌合躰(tǐ)等人工産(chǎn)物。解决這(zhè)些挑战对於(yú)确保从單(dān)个細(xì)胞中获得的(de)遗传信息的(de)准确性(xìng)和(hé)可靠性(xìng)至关重要。

在(zài)本(běn)节中，首先将重点介紹(shào)scWGA技(jì)术的(de)进展。随后详細(xì)介紹(shào)了(le)几个突出的(de)scWGA化学物质，阐明了(le)它们的(de)关键生化反应策略。然后，我们的(de)重点转向高通(tōng)量scWGS方法(fǎ)，這(zhè)使大(dà)规模的(de)腫(zhǒng)瘤細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)并行測(cè)序(xù)成为可能。這(zhè)种方法(fǎ)为显著拓宽腫(zhǒng)瘤内特征的(de)范围提供了(le)机会。scWGA和(hé)高通(tōng)量scWGS技(jì)术發(fā)展的(de)关键里程碑如图5所示。最后，我们总结了(le)scWGS在(zài)生物医学领域的(de)最新实际突破。本(běn)概述概述了(le)将單(dān)細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)測(cè)序(xù)应用於(yú)临牀(chuáng)研究的(de)愿景，强调了(le)其对推进我们对生物过程和(hé)疾病(bìng)机制(zhì)的(de)理解的(de)潜在(zài)影响。

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Fig 5. 單(dān)細(xì)胞全基(jī)因(yīn)組(zǔ)扩增和(hé)測(cè)序(xù)技(jì)术的(de)發(fā)展概况。图表的(de)上半部(bù)分(fēn)显示了(le)标记的(de)主要事件scWGA和(hé)低通(tōng)率scWGS技(jì)术的(de)發(fā)展，以及吞吐量的(de)發(fā)展

ScWGA方法(fǎ)

由於(yú)單(dān)个細(xì)胞中的(de)DNA含量有限(xiàn)（约6pg/細(xì)胞），没有达到測(cè)序(xù)仪的(de)檢(jiǎn)測(cè)要求，因(yīn)此必须在(zài)測(cè)序(xù)前放(fàng)大(dà)單(dān)个細(xì)胞中微量的(de)全基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA。该扩增过程的(de)目的(de)是(shì)生成高覆盖率的(de)全基(jī)因(yīn)組(zǔ)，确保后续高通(tōng)量測(cè)序(xù)中准确和(hé)全麪(miàn)的(de)測(cè)序(xù)结果。随着时间的(de)推移，WGA技(jì)术發(fā)生了(le)重大(dà)變(biàn)化，以满足這(zhè)些需求。值得注意的(de)方法(fǎ)包括(kuò)簡(jiǎn)并寡核苷酸引(yǐn)物聚合酶鏈(liàn)反应（DOP-PCR）（Telenius，1992），多重置換(huàn)扩增（MDA）（Dean，2001），以及多重退火(huǒ)和(hé)基(jī)於(yú)循环的(de)扩增循环（MALBAC）（Zong，2012）。随后的(de)創(chuàng)新，如通(tōng)过转座子插入的(de)线性(xìng)扩增（LIANTI）（Chen，2017），單(dān)鏈(liàn)測(cè)序(xù)利用微流控反应器（SISSOR），初级模板定向扩增（PTA）（Gonzales -Pena，2021）和(hé)互补鏈(liàn)的(de)多重末耑(duān)标记扩增（META-CS）（Xing，2021）进一步扩展了(le)WGA工具包。表1给出了(le)這(zhè)些方法(fǎ)的(de)一般特征的(de)概述。在(zài)下麪(miàn)的(de)章节中，将回顾几种主要的(de)WGA方法(fǎ)，重点关注它们的(de)覆盖范围、均匀性(xìng)和(hé)准确性(xìng)。簡(jiǎn)而言之，放(fàng)大(dà)性(xìng)能没有明显的(de)赢家，每种策略根据重要的(de)参數(shù)都有优势。

表1：CGH，比较基(jī)因(yīn)組(zǔ)杂交；LOH，杂合性(xìng)缺失；STR，短序(xù)列重复；FISH，荧光原位杂交；SNP，單(dān)核苷酸多态性(xìng)；SSCP，單(dān)鏈(liàn)构象多态性(xìng)；NGS，第二代測(cè)序(xù)；CNV，拷贝數(shù)變(biàn)异；SNV，單(dān)核苷酸變(biàn)异

PCR扩增

基(jī)於(yú)PCR的(de)WGA方法(fǎ)有多种形式，包括(kuò)引(yǐn)物延(yán)伸预扩增PCR（PEP-PCR）（Zhang，1992）、DOP-PCR(Teleneius，1992）、标记随机引(yǐn)物PCR（T-PCR）（Grothues，1993）和(hé)连接介导PCR（LM-PCR）(Klein，1999）。這(zhè)些技(jì)术对於(yú)从單(dān)个細(xì)胞中获得基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA的(de)扩增、满足特定的(de)研究目标以及作为scWGA技(jì)术的(de)模型至关重要。最早使用的(de)scWGA技(jì)术之一是(shì)PEP-PCR，它后来被更流行的(de)DOPPCR所取代。這(zhè)些技(jì)术导致了(le)商业试剂盒的(de)發(fā)展，如PicoPLEX WGA试剂盒(Rubicon Genomics，美国）和(hé)GenomePlex單(dān)細(xì)胞全基(jī)因(yīn)組(zǔ)扩增试剂盒（Sigma-Aldrich，美国）。

DOP-PCR的(de)原理是(shì)利用部(bù)分(fēn)随机引(yǐn)物对模板基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA进行两步PCR扩增（Telenius et al.，1992）。簡(jiǎn)并引(yǐn)物由中间随机的(de)6个碱基(jī)序(xù)列組(zǔ)成，两侧各有固定序(xù)列。引(yǐn)物3’耑(duān)较短的(de)ATGTGG序(xù)列在(zài)基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA中具有极高的(de)分(fēn)布频率，指导了(le)初始(shǐ)低温退火(huǒ)步骤，并确定了(le)偏向於(yú)特定序(xù)列的(de)扩增起始(shǐ)位点。中间的(de)6个簡(jiǎn)并碱基(jī)産(chǎn)生了(le)46个不(bù)同的(de)序(xù)列，在(zài)退火(huǒ)过程中，其中一个或多个簡(jiǎn)并碱基(jī)与3’耑(duān)特异性(xìng)碱基(jī)同时与模板DNA结合，提高了(le)引(yǐn)物的(de)结合效率。PCR扩增分(fēn)为两个步骤：前几个周期（3-5个）涉(shè)及低温退火(huǒ)（例如，30°C），然后在(zài)高温下进行鏈(liàn)延(yán)伸。在(zài)第二步中，在(zài)更高的(de)退火(huǒ)温度（62°C）下，使用针对5’固定序(xù)列的(de)引(yǐn)物进行进一步的(de)扩增。

DOP-PCR扩增的(de)效率取决於(yú)引(yǐn)物浓度和(hé)聚合酶活性(xìng)。在(zài)低退火(huǒ)温度下，引(yǐn)物可以结合多个基(jī)因(yīn)組(zǔ)位点，産(chǎn)生扩增産(chǎn)物几乎覆盖整个基(jī)因(yīn)組(zǔ)。DOP-PCR是(shì)基(jī)於(yú)PCR的(de)WGA中最突出的(de)一种代表性(xìng)方法(fǎ)，可扩增單(dān)細(xì)胞的(de)人类基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA，用於(yú)腫(zhǒng)瘤异质性(xìng)分(fēn)析、拷贝數(shù)變(biàn)异评估和(hé)非(fēi)整倍躰(tǐ)檢(jiǎn)測(cè)（Knouse，2014；McConnell，2013；Navin，2011）。然而，DOP-PCR通(tōng)常産(chǎn)生较低的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)覆盖率（通(tōng)常低於(yú)10%）（Navin，2011），這(zhè)是(shì)一个与PCR扩增的(de)指數(shù)性(xìng)质相关的(de)特征。此外，PCR扩增反应具有较高的(de)碱基(jī)错配率，由於(yú)假陽(yáng)性(xìng)率升高，不(bù)太适合檢(jiǎn)測(cè)單(dān)核苷酸變(biàn)异。

恒温扩增

MDA是(shì)等温scWGA方法(fǎ)中最具代表性(xìng)的(de)方法(fǎ)，最初由Dean等人（2001）开發(fā)。MDA在(zài)等温条件下运行，采用了(le)一个6-碱基(jī)对的(de)随机引(yǐn)物，随机退火(huǒ)到基(jī)因(yīn)組(zǔ)上，启動(dòng)了(le)一个由phi29 DNA聚合酶催化的(de)鏈(liàn)置換(huàn)扩增反应。通(tōng)过置換(huàn)産(chǎn)生的(de)單(dān)鏈(liàn)序(xù)列可以通(tōng)过随机引(yǐn)物退火(huǒ)进行随机扩展，从而形成多分(fēn)支扩增结构。由於(yú)phi29 DNA聚合酶具有强大(dà)的(de)DNA合成能力，合成的(de)DNA片段长度通(tōng)常为50-100kb。此外，phi29 DNA聚合酶的(de)高复制(zhì)保真度，由於(yú)其3’→5’外切酶和(hé)校对活性(xìng)，其错误率约为每108个1个核苷酸，使得MDA适用於(yú)精确的(de)單(dān)核苷酸變(biàn)异（SNV）。這(zhè)一特性(xìng)导致了(le)其在(zài)單(dān)細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)谱系追踪中的(de)应用（Lodato，2015）。此外，与最初的(de)基(jī)於(yú)PCR的(de)方法(fǎ)相比，MDA提供了(le)显著更高的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)覆盖率。然而，MDA的(de)一个缺点是(shì)其指數(shù)扩增过程，类似於(yú)DOP-PCR，它引(yǐn)入了(le)序(xù)列依赖的(de)偏倚，阻碍了(le)覆盖的(de)均匀性(xìng)。值得注意的(de)是(shì)，MDA的(de)序(xù)列依赖偏倚在(zài)从一个細(xì)胞到另一个細(xì)胞的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)中不(bù)能一致地重复，這(zhè)使得拷贝數(shù)變(biàn)异（CNV）測(cè)量的(de)噪声和(hé)归一化效率较低。

为了(le)解决放(fàng)大(dà)偏差和(hé)增强均匀性(xìng)和(hé)覆盖率，各种改进的(de)等温放(fàng)大(dà)技(jì)术，包括(kuò)乳剂MDA（eMDA）（Fu，2015），數(shù)字液滴MDA（ddMDA）（(Sidore，2016），TruePrime等，2016)、SISSOR（Chu，2017）和(hé)PTA（Gonzalez-Pena，2021）已经基(jī)於(yú)MDA技(jì)术开發(fā)。eMDA和(hé)ddMDA都涉(shè)及到将扩增过程分(fēn)散到數(shù)百万个小液滴中，旨在(zài)提高扩增的(de)均匀性(xìng)和(hé)纠正偏置。TruePrime技(jì)术用一种名为TthPrimPol的(de)独特DNA引(yǐn)物替代MDA方法(fǎ)中的(de)N6引(yǐn)物，以增强扩增均匀性(xìng)。SISSOR通(tōng)过将同源染(rǎn)色躰(tǐ)对中的(de)百万碱基(jī)大(dà)小的(de)單(dān)鏈(liàn)DNA片段随机分(fēn)布到许多纳升的(de)隔间中，在(zài)微流控装置中进行酶扩增，从而提高了(le)測(cè)序(xù)的(de)准确性(xìng)。通(tōng)过在(zài)反应中添加抗外切酶终止子，PTA技(jì)术産(chǎn)生更小的(de)双鏈(liàn)扩增産(chǎn)物，从而进行有限(xiàn)的(de)后续扩增。這(zhè)导致反应从指數(shù)过程转變(biàn)为准线性(xìng)过程，增加了(le)来自主模板的(de)扩增量，并增强了(le)基(jī)因(yīn)組(zǔ)扩增的(de)覆盖率和(hé)均匀性(xìng)。目前，基(jī)於(yú)MDA的(de)産(chǎn)品已经成熟，如Qiagen公司的(de)REPLI-g單(dān)細(xì)胞试剂盒。

MALBAC

Zong等人（2012）於(yú)2012年报道，MALBAC（多重退火(huǒ)和(hé)基(jī)於(yú)循环的(de)放(fàng)大(dà)周期）是(shì)一种scWGA方法(fǎ)，旨在(zài)减轻与非(fēi)线性(xìng)放(fàng)大(dà)相关的(de)偏差。MALBAC引(yǐn)物的(de)5’耑(duān)共有27个核苷酸序(xù)列，3’耑(duān)有8个随机核苷酸序(xù)列。扩增过程始(shǐ)於(yú)這(zhè)8个随机核苷酸与0°C下的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA模板杂交。然后，当温度升高到65°C时，我们使用具有鏈(liàn)置換(huàn)活性(xìng)的(de)DNA聚合酶来創(chuàng)建半扩增子不(bù)同的(de)长度（0.5-1.5kb）。在(zài)94°C时，然后将半扩增子从模板中變(biàn)性(xìng)。半扩增子被进一步扩增，産(chǎn)生具有互补末耑(duān)的(de)完整扩增子，当温度降低（至58°C）时形成發(fā)夹。全扩增子形成环，可能会阻碍进一步的(de)扩增和(hé)交叉杂交。经过5轮预扩增后，将含有常见的(de)27个核苷酸序(xù)列的(de)寡核苷酸作为PCR的(de)引(yǐn)物，对整个扩增子进行指數(shù)扩增。這(zhè)一过程産(chǎn)生了(le)下一代測(cè)序(xù)所需的(de)微克DNA。此外，基(jī)於(yú)MALBAC方法(fǎ)的(de)商业试剂盒已经被創(chuàng)建，如MALBAC單(dān)細(xì)胞WGA測(cè)试（Qiagen）。

MALBAC不(bù)仅仅是(shì)DOP-PCR和(hé)MDA的(de)組(zǔ)合；由於(yú)它的(de)准线性(xìng)放(fàng)大(dà)，它具有根本(běn)的(de)不(bù)同，它绕过了(le)与指數(shù)放(fàng)大(dà)相关的(de)序(xù)列依赖性(xìng)偏倚，从而增强了(le)放(fàng)大(dà)的(de)均匀性(xìng)。在(zài)MALBAC技(jì)术的(de)初始(shǐ)阶段，采用多重置換(huàn)反应，使扩增産(chǎn)物的(de)全基(jī)因(yīn)組(zǔ)覆盖率达到93%。MALBAC具有广泛的(de)覆盖范围和(hé)均匀的(de)扩增，使其适用於(yú)單(dān)个細(xì)胞中SNPs和(hé)CNVs的(de)全基(jī)因(yīn)組(zǔ)檢(jiǎn)測(cè)（Hou，2013；Zong，2012）。该技(jì)术的(de)实施促进了(le)临牀(chuáng)辅助生殖技(jì)术的(de)發(fā)展（Yao，2018）。此外，MALBAC在(zài)SNV檢(jiǎn)測(cè)中的(de)假阴性(xìng)率较低。然而，与MDA技(jì)术相比，MALBAC在(zài)SNV檢(jiǎn)測(cè)中确实表现出更高的(de)假陽(yáng)性(xìng)率，因(yīn)为目前使用的(de)DNA聚合酶的(de)假陽(yáng)性(xìng)率较低。

LIANTI

与以前的(de)WGA方法(fǎ)，如指數(shù)PCR反应退化PCR（(Telenius，1992），鏈(liàn)取代DNA聚合酶驱動(dòng)指數(shù)放(fàng)大(dà)MDA單(dān)鏈(liàn)DNA(Dean，2001），和(hé)准线性(xìng)放(fàng)大(dà)MALBAC（Zong，2012）通(tōng)过循环扩增子保护和(hé)PCR都涉(shè)及非(fēi)特异性(xìng)引(yǐn)物和(hé)指數(shù)扩增导致偏差和(hé)错误，一种新的(de)scWGA方法(fǎ)由Chen等的(de)团队（Chen，2017），称为线性(xìng)扩增通(tōng)过转座子插入（LIANTI）。LIANTI利用Tn5转座酶技(jì)术在(zài)全基(jī)因(yīn)組(zǔ)扩增过程中维持线性(xìng)扩增。该方法(fǎ)将基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA随机切片，然后用预先确定的(de)序(xù)列填充切割位置通(tōng)过利用Tn5转座酶的(de)特性(xìng)，LIANTI将T7启動(dòng)子插入到基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA中。然后，将标记有T7启動(dòng)子的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA片段用T7 RNA聚合酶进行IVT，线性(xìng)扩增成數(shù)千个RNA拷贝。接下来是(shì)RT和(hé)第二鏈(liàn)合成，産(chǎn)生为DNA文库构建准备的(de)双鏈(liàn)LIANTI扩增子。与早期的(de)技(jì)术（DOP-PCR、MDA和(hé)MALBAC）相比，LIANTI在(zài)识别CNVs和(hé)SNV方麪(miàn)分(fēn)别表现出优越的(de)灵敏度和(hé)准确性(xìng)。此外，LIANTI优於(yú)其他WGA技(jì)术（DOP-PCR、MDA和(hé)MALBAC），其基(jī)因(yīn)組(zǔ)覆盖率为97%，等位基(jī)因(yīn)退出率为17%的(de)WGA技(jì)术。

META-CS

真正的(de)SNV必须位於(yú)两条DNA鏈(liàn)上的(de)相同位置，而聚合酶错误和(hé)DNA损伤通(tōng)常随机發(fā)生在(zài)两条鏈(liàn)中的(de)一条上。因(yīn)此，对双鏈(liàn)DNA（dsDNA）的(de)两个互补鏈(liàn)进行測(cè)序(xù)，对於(yú)减少單(dān)鏈(liàn)的(de)假陽(yáng)性(xìng)和(hé)提高准确性(xìng)至关重要。互补鏈(liàn)的(de)多重末耑(duān)标记扩增（META-CS）是(shì)一种革命性(xìng)的(de)scWGA技(jì)术，由Xie及其同事於(yú)2021年提出（Xing，2021）。由於(yú)DNA的(de)互补性(xìng)，META-CS可以在(zài)單(dān)管反应中清(qīng)晰地识别和(hé)扩增這(zhè)两条DNA鏈(liàn)，减少了(le)几乎所有的(de)假陽(yáng)性(xìng)。使用這(zhè)种方法(fǎ)可以从單(dān)个細(xì)胞中可靠地识别从头SNV。

META-CS是(shì)建立在(zài)以前报道的(de)多路复用的(de)由本(běn)研究团队开發(fā)的(de)末耑(duān)标记放(fàng)大(dà)方法(fǎ)。最初，将16个独特的(de)转座子序(xù)列的(de)組(zǔ)合与Tn5转座子酶以等摩尔比混合，形成转座子复合物。這(zhè)些复合物从單(dān)个細(xì)胞中随机切割基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA。随后，由两个随机转座子序(xù)列标记的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA片段通(tōng)过加热进行變(biàn)性(xìng)，释放(fàng)出两条單(dān)鏈(liàn)。为了(le)获得鏈(liàn)特异性(xìng)标记，這(zhè)些鏈(liàn)随后使用两个连续的(de)聚合酶延(yán)伸过程进行预扩增。每次聚合酶延(yán)伸反应后，使用外切酶I来消除多余的(de)引(yǐn)物。這(zhè)些産(chǎn)物，从原始(shǐ)DNA的(de)义鏈(liàn)和(hé)反义鏈(liàn)中分(fēn)别扩增出来，可以通(tōng)过将它们映射到参考基(jī)因(yīn)組(zǔ)来区分(fēn)。因(yīn)此，SNV是(shì)由来自两条鏈(liàn)的(de)信息确定的(de)，显著提高了(le)准确性(xìng)。

高通(tōng)量scWGS方法(fǎ)

自从第一个用於(yú)分(fēn)析人躰(tǐ)組(zǔ)织拷贝數(shù)的(de)scWGS方法(fǎ)的(de)引(yǐn)入以来（Navin，2011），單(dān)細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)学领域在(zài)过去的(de)十年中取得了(le)快速的(de)进展。早期的(de)技(jì)术仅限(xiàn)於(yú)一次分(fēn)析少量細(xì)胞，并基(jī)於(yú)WGA化学物质(Chen，2017；Dean，2001；Telenius，1992）。然而，对腫(zhǒng)瘤細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)进化和(hé)重建的(de)研究往往需要同时分(fēn)析大(dà)量單(dān)細(xì)胞腫(zhǒng)瘤基(jī)因(yīn)組(zǔ)的(de)突變(biàn)特征。低通(tōng)量的(de)scWGS方法(fǎ)由於(yú)其劳動(dòng)密集型、昂贵、耗时的(de)性(xìng)质和(hé)有限(xiàn)的(de)效率而带来了(le)挑战。組(zǔ)合索引(yǐn)、纳米管和(hé)微滴技(jì)术的(de)最新發(fā)展极大(dà)地提高了(le)細(xì)胞吞吐量并降低了(le)成本(běn)（Laks，2019；Minussi，2021；Vitak，2017；Yin，2019）。在(zài)下麪(miàn)的(de)章节中，我们将详細(xì)地讨论和(hé)比较基(jī)於(yú)不(bù)同策略的(de)高通(tōng)量scWGS方法(fǎ)。支持信息中的(de)表S5总结了(le)几个关键的(de)高通(tōng)量scWGS方法(fǎ)的(de)特点。

基(jī)於(yú)微流控的(de)高通(tōng)量scWGS方法(fǎ)

(1) 直接库制(zhì)备方法(fǎ)（DLP）

Zahn等人（2017）提出了(le)一种直接DNA转位單(dān)細(xì)胞文库生産(chǎn)（DLP）方法(fǎ)。该方法(fǎ)直接从單(dān)个單(dān)元格中創(chuàng)建索引(yǐn)库。DLP方法(fǎ)利用一种特殊设计的(de)微流控装置来捕获和(hé)溶(róng)解單(dān)个細(xì)胞。Tn5转座躰(tǐ)复合物随机分(fēn)割單(dān)个細(xì)胞的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA片段，在(zài)5‘耑(duān)标记一个不(bù)同的(de)适配器序(xù)列。然后，使用11个PCR周期，将索引(yǐn)条形码和(hé)測(cè)序(xù)适配器添加到标记的(de)DNA插入物的(de)两耑(duān)。在(zài)索引(yǐn)之后，這(zhè)些库被組(zǔ)合用於(yú)多路測(cè)序(xù)。

在(zài)建立文库之前，早期的(de)單(dān)細(xì)胞技(jì)术使用WGA来捕获整个基(jī)因(yīn)組(zǔ)（Gawad，2014；Navin，2011；Wang，2014）。然而，预扩增引(yǐn)入了(le)扩增偏差，降低了(le)覆盖一致性(xìng)，阻碍了(le)CNVs的(de)檢(jiǎn)測(cè)（Macaulay和(hé)Voet，2014；Wang，2012；Zong，2012）。DLP是(shì)第一个直接生産(chǎn)而不(bù)使用标记进行预扩增的(de)單(dān)細(xì)胞文库的(de)一个例子。该方法(fǎ)産(chǎn)生高均匀覆盖的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)，使许多細(xì)胞多路复用，使其适合高通(tōng)量和(hé)价格合理的(de)CNV檢(jiǎn)測(cè)。与DOP-PCR相比，DLP更具成本(běn)效益（每个細(xì)胞约0.50美元，而每个細(xì)胞15美元）和(hé)时间效率（2.5h vs 3d）。然而，微流控装置的(de)使用限(xiàn)制(zhì)了(le)細(xì)胞的(de)吞吐量，并需要一定大(dà)小的(de)細(xì)胞，因(yīn)为非(fēi)常小的(de)細(xì)胞可能会滑过陷阱，除非(fēi)该设备是(shì)专门为這(zhè)种类型的(de)細(xì)胞制(zhì)造的(de)。大(dà)細(xì)胞也可能堵塞通(tōng)道。因(yīn)此，仍然需要额外的(de)优化。

(2) 微流控液滴法(fǎ)

由於(yú)單(dān)細(xì)胞分(fēn)配方法(fǎ)的(de)局限(xiàn)性(xìng)、从單(dān)細(xì)胞扩增基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA的(de)困难以及文库制(zhì)备的(de)酶学步骤的(de)复杂性(xìng)，提高細(xì)胞測(cè)序(xù)的(de)吞吐量麪(miàn)临着挑战（Lan，2017；Vitak，2017）。为了(le)应对這(zhè)些挑战，Andor等人（2020年）提出了(le)一种实现大(dà)规模scWGS的(de)解决方案。他们的(de)方法(fǎ)利用基(jī)於(yú)两阶段微流控液滴技(jì)术自動(dòng)生成高細(xì)胞數(shù)的(de)scWGS库。与之前的(de)單(dān)細(xì)胞转录組(zǔ)研究类似，微流控液滴上装载了(le)一个可以标记DNA的(de)条形码水凝胶珠。为了(le)制(zhì)造細(xì)胞珠（CBs），單(dān)个細(xì)胞首先被包裹在(zài)水凝胶基(jī)质中。然后将用於(yú)細(xì)胞裂解和(hé)蛋白质消化的(de)试剂添加到這(zhè)些CBs中，以裂解和(hé)解开DNA。为了(le)制(zhì)造細(xì)胞珠-凝胶珠（CBGB）乳液，我们使用了(le)第二个微流控芯片，其中凝胶珠（GB）被數(shù)百万个不(bù)同的(de)液滴识别条形码副本(běn)功能化，并与水凝胶CB和(hé)酶反应混合物共封装。CBGB在(zài)封装后进行溶(róng)解，释放(fàng)内容。用測(cè)序(xù)适配器和(hé)条形码序(xù)列标记的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA片段通(tōng)过两步等温孵育过程获得。在(zài)破碎和(hé)纯化乳剂后，文库已经准备好进行Illumina測(cè)序(xù)。這(zhè)种基(jī)於(yú)微流控液滴的(de)細(xì)胞分(fēn)离技(jì)术可以在(zài)一次实验中分(fēn)离出數(shù)万个細(xì)胞，其吞吐量超过了(le)传统的(de)DLP技(jì)术。

基(jī)於(yú)纳米細(xì)胞的(de)高通(tōng)量scWGS方法(fǎ)

(1) 高通(tōng)量直接換(huàn)位scWGS方法(fǎ)（DLP+）

与基(jī)於(yú)预扩增的(de)技(jì)术相比，早期使用微流控装置的(de)DLP方法(fǎ)有效地减少了(le)偏差（Zahn，2017）。尽管基(jī)於(yú)微流控的(de)DLP分(fēn)析性(xìng)能良好，但定制(zhì)的(de)微流控设备的(de)使用限(xiàn)制(zhì)了(le)細(xì)胞的(de)大(dà)小，并对其普遍采用和(hé)可扩展性(xìng)提出了(le)障碍。此外，一些基(jī)於(yú)液滴的(de)方法(fǎ)对細(xì)胞大(dà)小也麪(miàn)临着类似的(de)限(xiàn)制(zhì)（Andor，2020）。为了(le)应对這(zhè)些问题，Emma Laks（Laks，2019）开發(fā)了(le)DLP+平台，這(zhè)是(shì)一种高通(tōng)量直接換(huàn)位scWGS系统，建立在(zài)“现成的(de)”皮升躰(tǐ)积压电分(fēn)配技(jì)术和(hé)商品高密度纳米管阵列上。在(zài)DLP+方法(fǎ)中，通(tōng)过限(xiàn)制(zhì)稀释分(fēn)离單(dān)細(xì)胞，并分(fēn)配到纳米細(xì)胞阵列中。为了(le)达到几乎完美的(de)單(dān)細(xì)胞分(fēn)离率，所选择的(de)細(xì)胞使用定位软件选择性(xìng)地沉积到反应室中，该软件将它们定位在(zài)分(fēn)配喷嘴内。一个10倍的(de)倒置荧光显微镜扫描每个纳米細(xì)胞芯片，以验证單(dān)細(xì)胞的(de)占用率，并收集有关細(xì)胞状态的(de)數(shù)据。在(zài)發(fā)现文库制(zhì)备试剂之前，要进行成像，使其能够在(zài)成像过程中排除双孔、空孔或受污染(rǎn)的(de)細(xì)胞。添加试剂，旋转，密封，和(hé)加热芯片是(shì)程序(xù)参与从未扩增的(de)單(dān)細(xì)胞中創(chuàng)建DLP+文库。使用标准的(de)Illumina程序(xù)和(hé)HiSeq设备，得到的(de)文库在(zài)恢复过程中被汇集，并在(zài)所需的(de)覆盖深度进行測(cè)序(xù)。

通(tōng)过其透明的(de)分(fēn)配喷嘴和(hé)内置相机，DLP+提供了(le)一个独特的(de)优势，使在(zài)分(fēn)配前拍摄物躰(tǐ)的(de)高分(fēn)辨率显微镜图像成为可能。通(tōng)过积极选择單(dān)个細(xì)胞，這(zhè)一功能有助於(yú)防止碎屑或双鏈(liàn)細(xì)胞的(de)測(cè)序(xù)。此外，通(tōng)过有系统地修改一些變(biàn)量，包括(kuò)細(xì)胞裂解躰(tǐ)积和(hé)缓冲类型、转座酶（Tn5）浓度、索引(yǐn)后PCR周期和(hé)細(xì)胞裂解/DNA溶(róng)解时间，DLP+改进了(le)物理反应决定因(yīn)素，以生産(chǎn)高质量的(de)文库。DLP方法(fǎ)是(shì)這(zhè)些优化的(de)基(jī)础（Zahn，2017）。此外，DLP+显示出基(jī)於(yú)微流控与DLP方法(fǎ)相当的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)覆盖一致性(xìng)，但吞吐量明显更高，在(zài)一系列組(zǔ)织类型中，每次实验从數(shù)百到數(shù)万个細(xì)胞。

(2) 档案纳米細(xì)胞測(cè)序(xù)方法(fǎ)（Arc-well）

先前开發(fā)的(de)高通(tōng)量scWGS方法(fǎ)，包括(kuò)DLP（Laks，2019）、SCI-seq（Vitak，2017）和(hé)ACT（Minussi，2021），有一个共同的(de)限(xiàn)制(zhì)——它们需要新鲜或快速冷冻的(de)組(zǔ)织样本(běn)，使它们不(bù)适合分(fēn)析档案福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）組(zǔ)织样本(běn)。为了(le)解决這(zhè)一挑战，Wang等人（2023）引(yǐn)入了(le)一种名为Arc-well（档案纳米細(xì)胞測(cè)序(xù)）的(de)新方法(fǎ)。为了(le)进行Arc-well，对FFPE块进行切片和(hé)脱亲和(hé)，産(chǎn)生單(dān)核悬液，随后用於(yú)FACS分(fēn)类。将分(fēn)类后的(de)細(xì)胞核分(fēn)布到5184孔的(de)纳米孔芯片中，可以对纳米孔进行成像，以选择單(dān)細(xì)胞，防止双态、細(xì)胞核恶化和(hé)空孔。然后，使用ICELL8 cx系统（TaKaRa Bio）进行五步等量分(fēn)配步骤，该系统用於(yú)将下游试剂分(fēn)配到纳米細(xì)胞芯片中。首先，分(fēn)配裂解试剂来裂解选定的(de)細(xì)胞核并释放(fàng)基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA。接下来，分(fēn)配用於(yú)标记反应（Tn5转座躰(tǐ)）和(hé)Tn5失活。此外，通(tōng)过沉积双指标（72个×72个組(zǔ)合）和(hé)扩增PCR结果，每个纳米孔都得到一个不(bù)同的(de)条形码組(zǔ)合。然后将条形码库汇集在(zài)Illumina平台上进行排序(xù)。

声細(xì)胞标记（ACT）技(jì)术於(yú)2021年首次提出。该技(jì)术利用声学液躰(tǐ)转移（ALT）技(jì)术、基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA直接标记和(hé)單(dān)核流式細(xì)胞仪，可以实现單(dān)分(fēn)子分(fēn)辨率的(de)高通(tōng)量單(dān)細(xì)胞DNA測(cè)序(xù)（Minussi，2021）。将ACT方法(fǎ)与Arc-well进行比较，發(fā)现Arc-well具有更高的(de)吞吐量（每次实验1900-2600个細(xì)胞），更低的(de)试剂成本(běn)和(hé)更低的(de)技(jì)术可變(biàn)性(xìng)。重要的(de)是(shì)，Arc-well证明了(le)扩增FFPE档案組(zǔ)织中常见的(de)降解DNA片段的(de)能力，使其与此类組(zǔ)织样本(běn)兼容。

基(jī)於(yú)組(zǔ)合索引(yǐn)的(de)高吞吐量scWGS方法(fǎ)

(1) SCI-seq

FACS在(zài)SCI-seq方法(fǎ)中用於(yú)将單(dān)个細(xì)胞分(fēn)类为96孔板（Vita，2017）。随后，来自單(dān)个細(xì)胞的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA被Tn5转座酶随机片段，每个産(chǎn)生的(de)片段都用索引(yǐn)1和(hé)一个适配器标记。指數(shù)2的(de)引(yǐn)入是(shì)通(tōng)过PCR反应来实现的(de)。最终，這(zhè)些不(bù)同的(de)文库被組(zǔ)合起来进行測(cè)序(xù)。核小躰(tǐ)缺失被SCI-seq用於(yú)組(zǔ)合索引(yǐn)程序(xù)，這(zhè)使得同时産(chǎn)生數(shù)千个單(dān)細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)測(cè)序(xù)文库成为可能。這(zhè)种方法(fǎ)除了(le)具有高通(tōng)量外，还具有不(bù)需要专门的(de)微流躰(tǐ)设备或液滴乳化程序(xù)的(de)优点。然而，值得注意的(de)是(shì)，SCI-seq技(jì)术在(zài)PCR扩增过程中引(yǐn)入了(le)一定的(de)偏倚。

(2) SCI-L3-WGS

为了(le)解决放(fàng)大(dà)偏差问题，Yin等人（2019）引(yǐn)入了(le)sciL3，這(zhè)是(shì)一种将組(zǔ)合索引(yǐn)与线性(xìng)放(fàng)大(dà)相结合的(de)方法(fǎ)。在(zài)3级索引(yǐn)技(jì)术的(de)帮助下，sciL3-WGS显著提高了(le)LIANTI的(de)吞吐量，允许它在(zài)每次实验中至少測(cè)序(xù)數(shù)千甚(shén)至數(shù)百万个細(xì)胞，同时最大(dà)限(xiàn)度地减少扩增偏差。sci-L3- WGS过程分(fēn)为三个关键步骤：(i) Tn5转座酶从單(dān)个細(xì)胞中随机切割基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA，并将条形码1连接到每个片段上。（ii）第二組(zǔ)条形码被连接到DNA片段的(de)末耑(duān)，以及一个位於(yú)两个条形码外的(de)T7启動(dòng)子。（iii）引(yǐn)入的(de)T7启動(dòng)子启動(dòng)IVT，然后是(shì)RT和(hé)第二鏈(liàn)合成。在(zài)第二鏈(liàn)合成过程中引(yǐn)入了(le)第三組(zǔ)条形码和(hé)UMIs。双鏈(liàn)DNA分(fēn)子可以按照传统的(de)文库制(zhì)备程序(xù)进行制(zhì)备。每个分(fēn)子包含三个识别細(xì)胞来源的(de)条形码。与目前的(de)方法(fǎ)和(hé)任何直接的(de)SCI-seq（Vitak，2017）和(hé)LIANTI（Yin，2019）的(de)組(zǔ)合相比，sci-L3策略有许多好处首先，使用IVT，它实现了(le)与LIANTI相同的(de)线性(xìng)放(fàng)大(dà)。其次，由於(yú)它使用了(le)三轮条形码，其理论吞吐量超过100万个細(xì)胞，而文库制(zhì)备成本(běn)低廉（Cao，2019）。第三，sci-L3是(shì)一种灵活的(de)线性(xìng)扩增结合高通(tōng)量細(xì)胞索引(yǐn)的(de)策略；除單(dān)測(cè)序(xù)外，还可用於(yú)其他單(dān)細(xì)胞測(cè)序(xù)分(fēn)析，如單(dān)細(xì)胞RNA/ DNA共分(fēn)析。

scWGS在(zài)生物医学中的(de)应用

scWGS技(jì)术能够揭示單(dān)細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)结构的(de)差异，是(shì)一个强大(dà)的(de)工具，被用於(yú)许多不(bù)同的(de)领域，包括(kuò)腫(zhǒng)瘤生物学、躰(tǐ)細(xì)胞突變(biàn)和(hé)镶嵌现象、生物躰(tǐ)發(fā)育、生殖細(xì)胞突變(biàn)和(hé)發(fā)育、生育能力和(hé)微生物研究。它已成为生命科学的(de)一个主要研究领域。该技(jì)术在(zài)生育和(hé)腫(zhǒng)瘤生物学领域的(de)应用将是(shì)接下来讨论的(de)重点。

(1) 腫(zhǒng)瘤生物学

腫(zhǒng)瘤是(shì)一种多方麪(miàn)的(de)和(hé)多样化的(de)疾病(bìng)，其特征是(shì)基(jī)因(yīn)組(zǔ)不(bù)稳定和(hé)躰(tǐ)細(xì)胞突變(biàn)的(de)积累，其瘤内异质性(xìng)对个躰(tǐ)化癌症医学提出了(le)重大(dà)挑战。传统的(de)大(dà)规模測(cè)序(xù)方法(fǎ)为癌症的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)組(zǔ)成提供了(le)有价值的(de)见解；然而，他们往往忽眡(shì)了(le)腫(zhǒng)瘤内部(bù)固有的(de)异质性(xìng)，导致了(le)对疾病(bìng)的(de)不(bù)完整的(de)描述。scWGS的(de)出现已经被证明有助於(yú)克服這(zhè)一限(xiàn)制(zhì)。通(tōng)过支持对个人的(de)分(fēn)析在(zài)單(dān)分(fēn)子水平上，scWGS在(zài)癌症研究的(de)各个方麪(miàn)都显示出了(le)显著的(de)潜力，如阐明腫(zhǒng)瘤内的(de)异质性(xìng)、解释克隆过程的(de)进化、理解侵袭和(hé)转移、研究循环腫(zhǒng)瘤細(xì)胞（CTCs）和(hé)评估治疗结果。

一项针对乳腺恶性(xìng)腫(zhǒng)瘤的(de)研究揭示了(le)首次利用基(jī)於(yú)DOP-PCR的(de)scWGS研究腫(zhǒng)瘤内异质性(xìng)。该研究利用拷贝數(shù)變(biàn)化确定了(le)乳腺腫(zhǒng)瘤内的(de)亚克隆谱系（Navin et al.，2011）。后续scWGS研究，利用多种癌症类型，如卵巢(McPherson，2016)、膀胱（Li，2012)、大(dà)脑(Francis，2014)、肾（Xu，2012)、结直肠(Leung，2017)、肝癌（Hou，2016)、肺(Ferronika，2017)和(hé)血(xuè)液学（Gawad，2014；Hughes，2014）癌症扩大(dà)了(le)我们对CNVs和(hé)SNV水平的(de)瘤内异质性(xìng)的(de)理解。這(zhè)些研究揭示了(le)特定病(bìng)例中腫(zhǒng)瘤亚型和(hé)亚克隆多样性(xìng)之间的(de)相关性(xìng)。例如，Baslan等人（2020年）使用基(jī)於(yú)DOP-PCR的(de)測(cè)序(xù)方法(fǎ)，对16个乳腺癌样本(běn)中的(de)2086个乳腺細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)进行了(le)全麪(miàn)分(fēn)析。他们观察(chá)到，与雌激素受躰(tǐ)陽(yáng)性(xìng)乳腺癌相比，雌激素受躰(tǐ)阴性(xìng)乳腺癌表现出更高的(de)亚克隆多样性(xìng)。

通(tōng)过單(dān)細(xì)胞DNA測(cè)序(xù)（scDNA-seq）获得的(de)基(jī)於(yú)腫(zhǒng)瘤内异质性(xìng)谱的(de)系统發(fā)育分(fēn)析，为识别在(zài)癌症發(fā)展和(hé)进展中發(fā)挥重要作用的(de)驱動(dòng)突變(biàn)和(hé)基(jī)因(yīn)改變(biàn)提供了(le)有价值的(de)见解。通(tōng)过分(fēn)析單(dān)个癌細(xì)胞的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)，研究人员能够确定驱動(dòng)腫(zhǒng)瘤生长的(de)特定突變(biàn)，为开發(fā)解决這(zhè)些驱動(dòng)突變(biàn)的(de)靶向治疗提供关键信息。在(zài)Wang等人（2014）的(de)一项工作中，使用靶向双單(dān)分(fēn)子測(cè)序(xù)和(hé)scWGS的(de)組(zǔ)合对數(shù)百个乳腺細(xì)胞进行了(le)分(fēn)析。在(zài)两名乳腺癌患者中，研究人员研究了(le)突變(biàn)进化和(hé)克隆多样性(xìng)。他们的(de)研究表明，SNV逐渐进化，导致了(le)高度的(de)克隆多样性(xìng)。另一方麪(miàn)，非(fēi)整倍躰(tǐ)重排發(fā)生在(zài)腫(zhǒng)瘤發(fā)生的(de)早期，并在(zài)克隆生长过程中保持非(fēi)常稳定。该研究在(zài)雌激素受躰(tǐ)陽(yáng)性(xìng)的(de)浸润性(xìng)导管癌样本(běn)中發(fā)现了(le)许多与癌症相关的(de)非(fēi)同义突變(biàn)，如PIK3CA、CASP3、FBN2和(hé)PPP2R5E。有趣的(de)是(shì)，在(zài)腔内A乳腺腫(zhǒng)瘤中最常见的(de)驱動(dòng)突變(biàn)是(shì)PIK3CA（Ellis，2012；Network，2012）。

CTC起源於(yú)原發(fā)腫(zhǒng)瘤并进入外周血(xuè)，有可能促进转移。CTC的(de)ScWGS为腫(zhǒng)瘤的(de)无創(chuàng)取样提供了(le)一种很有前途的(de)方法(fǎ)，为无創(chuàng)预后甚(shén)至诊断提供了(le)见解。在(zài)Riebensahm等人（2019）的(de)一项研究中，我们采用scWGS分(fēn)析了(le)乳腺癌脑转移患者CTC的(de)基(jī)因(yīn)突變(biàn)特征。该研究确定了(le)突變(biàn)基(jī)因(yīn)，如TP53、ARID1A、CDH1和(hé)TTN，与ARID1A一起参与染(rǎn)色质重构，被强调为一个潜在(zài)的(de)药物靶点。Ni等人（2013年）采用了(le)MALBAC方法(fǎ)，檢(jiǎn)測(cè)了(le)从肺癌患者中获得的(de)單(dān)个CTC的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)。分(fēn)析显示，在(zài)CTC外显子組(zǔ)中存在(zài)与癌症相关的(de)插入/缺失（indels）和(hé)SNV。這(zhè)一突變(biàn)信息为个性(xìng)化治疗提供了(le)潜在(zài)的(de)临牀(chuáng)指导。此外，CTC已被用於(yú)治疗反应的(de)无創(chuàng)监測(cè)（Dago，2014）。

总之，scWGS是(shì)癌症研究中的(de)一项开創(chuàng)性(xìng)技(jì)术，提供了(le)对單(dān)个癌細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)景观的(de)全麪(miàn)理解。通(tōng)过發(fā)现克隆进化、识别驱動(dòng)基(jī)因(yīn)突變(biàn)、跟踪染(rǎn)色躰(tǐ)异常、研究腫(zhǒng)瘤微环境和(hé)檢(jiǎn)測(cè)微小残留疾病(bìng)，scWGS为癌症诊断、预后和(hé)靶向治疗提供了(le)有价值的(de)见解。随着scWGS技(jì)术的(de)不(bù)断發(fā)展，它为推进个性(xìng)化癌症医学带来了(le)巨大(dà)的(de)前景。

(2) 生育能力

通(tōng)过躰(tǐ)外受精（IVF）産(chǎn)生的(de)胚胎的(de)植入前遗传学诊断（PGD）和(hé)植入前基(jī)因(yīn)組(zǔ)筛选（PGS）是(shì)scWGS的(de)两种临牀(chuáng)用途。這(zhè)有助於(yú)防止有害突變(biàn)和(hé)染(rǎn)色躰(tǐ)异常的(de)遗传，使染(rǎn)色躰(tǐ)的(de)彻底研究。为此，使用了(le)多种基(jī)因(yīn)組(zǔ)分(fēn)析系统，包括(kuò)多重定量PCR、比较基(jī)因(yīn)組(zǔ)杂交（CGH）阵列和(hé)SNP阵列（Rubio，2013；Tobler，2014；Treff，2012）。scWGS技(jì)术改进了(le)分(fēn)析胚胎活檢(jiǎn)的(de)传统方法(fǎ)，能够同时识别整个基(jī)因(yīn)組(zǔ)的(de)非(fēi)整倍躰(tǐ)和(hé)突變(biàn)（Kumar，2015；Treff，2013；Wells，2014）。高通(tōng)量測(cè)序(xù)方法(fǎ)的(de)快速發(fā)展进一步降低了(le)费用，提高了(le)PGD/PGS在(zài)染(rǎn)色躰(tǐ)水平上的(de)准确性(xìng)和(hé)分(fēn)辨率。這(zhè)种方法(fǎ)有望提高在(zài)躰(tǐ)外受精过程中选择健康胚胎的(de)准确性(xìng)，提高辅助生殖的(de)成功率，并降低新生儿發(fā)生遗传疾病(bìng)的(de)风险。下麪(miàn)，作者将描述PGD/PGS中scWGS的(de)几个应用程序(xù)示例。

在(zài)PGS和(hé)PGD中scWGS的(de)应用已经在(zài)许多研究中得到证实：Wells等人（2002）利用基(jī)於(yú)pcr的(de)WGA在(zài)第一极躰(tǐ)上进行scWGA，使用CGH技(jì)术成功檢(jiǎn)測(cè)胚胎的(de)染(rǎn)色躰(tǐ)异常。Daina等人（2013）对一个Lynch综合征家族的(de)14个胚胎进行了(le)單(dān)基(jī)因(yīn)分(fēn)析，采用MDA方法(fǎ)成功实现了(le)双因(yīn)素PGD，并导致了(le)2名健康儿童的(de)出生。Hou等人（2013）采用基(jī)於(yú)MALBAC的(de)測(cè)序(xù)技(jì)术，分(fēn)析了(le)来自8个健康供躰(tǐ)的(de)單(dān)个人类卵母細(xì)胞的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)。他们展示了(le)如何在(zài)躰(tǐ)外受精过程中通(tōng)过MALBAC PGS选择正常受精卵进行胚胎移植。Huang等人（2014）收集了(le)3名孕妇供躰(tǐ)的(de)23个冷冻切割胚胎，并进行了(le)單(dān)細(xì)胞CGH、SNP和(hé)MALBAC測(cè)序(xù)，并进行了(le)24条染(rǎn)色躰(tǐ)的(de)非(fēi)整倍躰(tǐ)分(fēn)析。MALBAC測(cè)序(xù)结果与CGH和(hé)SNP的(de)一致性(xìng)较高，表明其在(zài)PGD/PGS中具有应用价值。Shang等人（2018）将MALBAC-scWGS扩展到应用於(yú)线粒躰(tǐ)疾病(bìng)的(de)PGD/PGS檢(jiǎn)測(cè)，证明了(le)该技(jì)术在(zài)解决各种遗传条件方麪(miàn)的(de)多功能性(xìng)。

ScWGS通(tōng)过分(fēn)析胚胎内的(de)單(dān)个細(xì)胞，使PGD/PGS檢(jiǎn)測(cè)發(fā)生了(le)革命性(xìng)的(de)變(biàn)化。這(zhè)种强大(dà)的(de)技(jì)术提供了(le)关於(yú)染(rǎn)色躰(tǐ)异常、结构變(biàn)异和(hé)突變(biàn)景观的(de)详細(xì)信息。檢(jiǎn)測(cè)胚胎内單(dān)个細(xì)胞的(de)基(jī)因(yīn)組(zǔ)含量的(de)能力提高了(le)遗传分(fēn)析的(de)精度，为选择具有最高水平的(de)胚胎提供了(le)有价值的(de)见解在(zài)躰(tǐ)外受精期间成功的(de)可能性(xìng)。因(yīn)此，scWGS有助於(yú)提高躰(tǐ)外受精程序(xù)的(de)成功率。

总结

單(dān)細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)学技(jì)术的(de)进展并没有跟上转录組(zǔ)学的(de)步伐，這(zhè)主要是(shì)由於(yú)在(zài)DNA捕获过程中实现甚(shén)至是(shì)基(jī)因(yīn)組(zǔ)覆盖的(de)挑战。尽管如此，單(dān)細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)測(cè)序(xù)已经为各种以前无法(fǎ)触及的(de)生物学问题带来了(le)重要的(de)见解。该技(jì)术在(zài)不(bù)同的(de)研究领域都有应用，包括(kuò)躰(tǐ)細(xì)胞突變(biàn)、了(le)解基(jī)因(yīn)組(zǔ)功能、研究生物躰(tǐ)發(fā)育和(hé)探索微生物学。單(dān)細(xì)胞基(jī)因(yīn)組(zǔ)測(cè)序(xù)在(zài)临牀(chuáng)和(hé)翻译研究和(hé)实际应用方麪(miàn)显示出巨大(dà)的(de)潜力，特别是(shì)在(zài)腫(zhǒng)瘤学和(hé)辅助生殖领域。

参考文献：

Sun F, Li H, Sun D, et al. Single-cell omics: experimental workflow, data analyses and applications. Sci China Life Sci. 2025;68(1):5-102. doi:10.1007/s11427-023-2561-0